Persistenza, stato di attività e rilevamento mediante metodi molecolari di batteri patogeni non coltivabili in campioni clinici (2005)

Starting date
January 1, 2005
Duration (months)
24
Managers or local contacts
Lleo'Fernandez Maria Del Mar
URL
2005064833_001
Keyword
PATOGENICITÀ;INFEZIONI RICORRENTI;BIOFILM;FORME VITALI NON COLTIVABILI;RILEVAMENTO DI PATOGENI;ESPRESSIONE DI GENI DI PATOGENICITÀ;CONDIZIONI DI STRESS;SOPRAVVIVENZA MICROBICA;FATTORI DI VIRULENZA

Nel processo infettivo i microrganismi patogeni si confrontano con ambienti spesso ostili per la presenza di sostanze che ne ostacolano lo sviluppo prodotte dall’ospite e dall’eventuale microbiota indigeno o assunte a fini terapeutici. Come risultato di queste interazioni, la crescita microbica è inibita e il processo infettivo è di norma arrestato. E' stato proposto da diversi Autori che, come dimostrato nell’ambiente, anche nell’ospite infettato le condizioni di stress possano indurre l’attivazione da parte dei microrganismi di forme particolari di resistenza non rilevabili con i saggi colturali tradizionali, come lo stato vitale ma non coltivabile (VBNC) dei batteri. Questi microrganismi quiescienti, permanendo nell’organismo ospite, potrebbero “riattivarsi” ed essere coinvolti nella recrudescenza della patologia e nelle cosiddette forme ricorrenti. In questo progetto si intende analizzare questa possibilità e mettere a punto saggi non colturali che permettano di rilevare la presenza di forme resistenti allo stress di batteri patogeni. Durante la prima parte del progetto verranno studiate in vitro le risposte di alcuni patogeni batterici Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis a condizioni di stress che mimano quelle presenti in vivo in diversi siti infetti, e la capacità dei microrganismi in esame di mantenere ed esprimere, in tali condizioni, le caratteristiche di virulenza. A questo scopo, per riprodurre gli ambienti nei quali le cellule microbiche analizzate si vengono a trovare durante il processo infettivo, saranno allestite colture in diversi liquidi biologici quali urine, sangue, liquido peritoneale e liquido ascitico. Alle colture verranno aggiunte concentrazioni sub-inibenti degli antibiotici più utilizzati nei confronti dei patogeni in esame, per valutarne l’attività come agenti in grado di indurre lo stato VBNC. Inoltre verranno prese in considerazione altre molecole presenti nel sito d'infezione o derivanti dalle difesa immunitaria dell'ospite che potrebbero indurre nei batteri lo stato di non coltivabilità.Altri esperimenti saranno eseguiti in modelli sperimentali che simulano la formazione di biofilm batterici su cateteri venosi centrali (CVC) e in modelli clinici riferiti a pazienti con gravi patologie epatiche e con alterazioni intestinali che portano ad un maggior rischio di infezione. Nella seconda fase del progetto si intende valutare il ruolo di forme microbiche di resistenza allo stress nella genesi di diversi tipi di patologie infettive andandone a ricercare l’eventuale presenza e stato di attività nei vari materiali patologici mediante saggi molecolari. Per le indagini batteriche (che complessivamente riguarderanno la ricerca di E. coli ed altre enterobatteriacee, E faecalis, S. epidermidis e S. aureus), saranno analizzati campioni liquidi (urine, liquido pleurico, liquido articolare, liquido ascitico, peritoneale, e sangue) prelevati da diverse tipologie di pazienti, e frammenti di CVC. I vari campioni saranno raccolti dalle tre Unità di ricerca coinvolte nel progetto e successivamente inviati alle diverse unità competenti. La storia clinica di ciascun paziente sarà registrata, con particolare attenzione alla terapia antibiotica. Per ogni tipo di campione saranno approntati protocolli specifici di estrazione del DNA e/o RNA e verranno eseguiti saggi di PCR, multiplex PCR ed RT-PCR per l’amplificazione di sequenze specie-specifiche; nella ricerca dei patogeni batterici, verranno anche eseguiti esperimenti di amplificazione “broad range” (16S rDNA e 16S rRNA). A seconda del materiale e dei microrganismi in esame, le Unità metteranno a punto diversi protocolli di PCR quantitativa (real time PCR o cPCR).Complessivamente, i risultati ottenuti consentiranno di valutare il rischio che forme batteriche vitali di resistenza allo stress rappresentano per la salute dell’uomo.

Sponsors:

Ministero dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca
Funds: assigned and managed by the department
Syllabus: COFIN - Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale

Project participants

Italo Vantini
Teaching Assistant

Activities

Research facilities