Predisposizione genetica e fattori di rischio clinici per l’insorgenza di neoplasie cutanee in pazienti trapiantati d’organo in terapia immunosoppressiva

Data inizio
31 maggio 2002
Durata (mesi) 
12
Responsabili (o referenti locali)
Barba Annalisa

Premessa
I pazienti trapiantati presentano un elevato rischio di tumori cutanei non melanoma: si stima un’incidenza cumulativa del 6,3% all’anno. La prevalenza varia dal 5 al 22% delle casistiche anglosassoni al 7,9-8,9% delle casistiche italiane. Il 50% dei pazienti affetti da un tumore cutaneo ne sviluppa un successivo; il riscontro anche di una decina di tumori non è eccezionale.
I principali fattori di rischio clinici per i tumori cutanei nei trapiantati sono: immunodepressione iatrogena, fenotipo (cute ed occhi chiari, capelli biondi), età al trapianto >40 anni, durata del follow-up > 5 anni, tipo di organo trapiantato (cuore vs. rene) entità della fotoesposizione pre e post trapianto, assetto HLA, razza caucasica, infezione da HPV, presenza di cheratosi attiniche.
Uno studio ha evidenziato, nella popolazione aperta una correlazione tra polimorfismi genici a carico dei geni codificanti per la Glutatione S transferasi (GSTM, GSTM3, GSTT1) ed il citocromo P450 (CYP1A1) ed un più elevato rischio di carcinomi basocellulari. I pazienti con genotipo GSTT null o CYP1A1 IIe/IIe avevano un OR 2.24 per carcinoma basocellulare rispetto ai controlli; la contemporanea presenza di entrambi i genotipi si correlava con un O.R di 2,95. Altri alleli (CYP2D6, CYP1A1) inducevano un rischio oncogeno minore (O.R. 1,26).
I pazienti trapiantati presentano un elevato rischio oncogeno nei cui confronti gli unici interventi possibili sono la sorveglianza clinica, la diagnosi precoce ed il trattamento chirurgico tempestivo.
La dimostrazione di una predisposizione genetica al cancro in aggiunta agli altri fattori di rischio (immunosoppressione,fenotipo) potrebbe consentire l’identificazione, sin dalla fase pre-trapianto, di sottopopolazioni di trapiantati a più elevato rischio per tumori cutanei, da sottoporre ad un monitoraggio dermatologico più accurato.

Materiali e metodi
Lo studio viene inteso come studio caso-controllo: ogni paziente affetto da neoplasia sarà abbinato a due controlli sani di analoga età e trapiantati nello stesso anno. Di tutti i pazienti (casi e controlli) saranno registrati: anamnesi familiare e personale per neoplasie cutanee, precedenti ustioni in età infantile, tipo di lavoro e di passatempi, abitudini di esposizione solare durante il lavoro, il tempo libero e le vacanze.
L’esame clinico rileva tipo e colorito cutaneo, colore d’occhi, capelli, presenza di lesioni pre-cancerose o di segni di un’intensa esposizione solare (lentiggini solari, efelidi).
A tutti i pazienti, previo consenso informato, saranno prelevati 5 ml di sangue per lo studio genetico.
MATERIALI E METODI:

La estrazione di DNA verrà effettuata da sangue periferico utilizzando la tecnica standard di “salting out”.

Genotipizzazione:
Per la genotipizzazione degli alleli GST si utilizzerà la tecnica di reazione a catena della polimerasi (PCR) con primers di sequenza specifica (PCR-SSP) che prevede l’utilizzo de identiche condizioni di amplificazioni per tutte le varianti di GST (Marshal et al 2000). Per i polimorfismi GSTM1A e GSTM1B si utilizzano primers con specificità allelica determinata dal nucleotide terminale in 3’. L’omozigosità per l’allele nullo è determinata dall’assenza di entrambi gli amplificati. I primers per GSTT1, determinano la presenza/assenza di una delezione in questo gene. Per la genotipizzazione delle varianti di GSTP1 si utilizzano per l’amplificazione dei primers allele-specifici, Forward e Revers, in grado di identificare il tipo di mutazione e l’orientamento cis/tras della stessa.. Per velocizzare la genotipizzazione, i primers per gli alleli GSTM1 e GSTT1 si utilizzano in una stessa reazione di PCR. Ogni mix di reazioni contiene primers controllo, in modo di verificare il successo dell’amplificazione. La sequenza dei primers, la composizione dei mix e la lunghezza dei frammenti amplificati, sono riassunte nella Tabella 1. La reazione di amplificazione viene realizzata in 13ul di mix contenente 0.25u diTaq polimerasi (Eurobio), 200mmol di ogni dATP, dTTP, dCTP e dGTP, buffer Taq, e adeguata concentrazione di primers per ogni reazione (Tabella 1).
Parametri ciclici d’amplificazione:
96°C x 1’, seguito da 5 cicli da 96°C per 25’’, 70°C per 45’’ e 72°C per 45’’, seguiti da 21 cicli da 96°C per 25’’, 65°C per 50’’ e 72°C per 45’’, seguito da 4 cicli da 96°C per 25’’, 55°C per 60’’ e 72°C per 120’’. Dopo amplificazione i prodotti verranno visualizzati mediante corse elettroforetiche in gel di agarosio al 3% contenente bromuro di etidio.

Per la genotipizzazione degli alleli CYP1A1, se utilizza una amplificazione genomica seguita di una digestione enzimatica. Per questa amplificazione se utilizza un primer Foward nell’introne 6 e un primer Reverse nel esone 7. Il primer Reverse è modificato in modo di creare un sito di restrizione per l’enzima Nco I nell’allele normale (Cantlay et al 1995, Smith et al 1996)). I prodotti di digestione verrano visualizzati mediante elettroforesi in gel di acrilamide al 10%, colorato con bromuro di etidio

Risultati attesi
Ci si attende di osservare una correlazione tra caratteristiche fenotipiche (colorito della cute e degli occhi) segni di fotodanneggiamento cutaneo, esposizione professionale e ricreazionale al sole e carcinoma cutaneo. Al termine dello studio si valuterà se la presenza di un particolare assetto genotipico sia un fattore di rischio aggiuntivo per l’insorgenza di cancro.
Nel caso tale ipotesi sia verificata sarebbe auspicabile la messa a punto di un test di screening per identificare, sin dall’immissione in lista di trapianto, i pazienti a più elevato rischio per tumori cutanei, da sottoporre ad un monitoraggio dermatologico più accurato.


BIBLIOGRAFIA

1.Birkeland SA, Lokkegard H, Storm HH. Cancer risk in patients on dialysis and after renal transplantation. Lancet 2000;355: 1886-1887.
2.Bouwes Bavinck JN, Vermeer BJ, Claas FHJ, Schegget JT, Van der Woude FJ. Skin cancer and renal transplantation. J Nephrol 1994;7:261-267.
3.Belloni Fortina A, Caforio AL, Piaserico S, Alaibac M, Tona F, Feltrin G,Livi U, Peserico A. Skin cancer in heart transplant recipients: frequency and risk factor analysis. J Heart Lung Transpl 2000; 19:249-255.

Enti finanziatori:

Ministero dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca
Finanziamento: assegnato e gestito dal Dipartimento

Partecipanti al progetto

Collaboratori esterni

Gianpaolo Tessari
Verona Scienze Biomediche e Chirurgiche Dottorando

Attività

Strutture