Le funzioni effettrici delle cellule appartenenti all'immunita' innata, come i neutrofili polimorfonucleati (PMN), i monociti/macrofagi e le cellule dendritiche (DC), giocano un ruolo chiave non solo nei meccanismi difensivi di tipo naturale ma anche in quelli di tipo adattativo. Nell’ultimo decennio, soprattutto grazie ai finanziamenti PRIN, il nostro gruppo ha contribuito notevolmente a svelare una nuova e inaspettata funzione dei neutrofili quali cellule in grado di produrre citochine appartenenti alle famiglie delle interleuchine, delle chemochine, dei fattori di crescita e del “tumor necrosis factor” (1,2). Abbiamo infatti dimostrato, in alcuni casi insieme a U.O. di questa cordata, che i neutrofili umani producono e rilasciano citochine proinfiammatorie e immunoregolatorie come per esempio IL-12, TNFalfa, TRAIL e BLyS (2-4), chemochine come CXCL8/IL-8, CXCL1/GROalfa, CXCL10/IP-10, CXCL9/MIG, CXCL11/I-TAC (5-8), CCL20/MIP-3alfa e CCL19/MIP-3beta (9), e citochine che svolgono un ruolo cruciale nei fenomeni angiogenetici e fibrogenetici come VEGF e HB-EGF (10,11). Grazie ai nostri studi, e a quelli di gruppi che hanno riprodotto e sviluppato le nostre osservazioni in modelli sperimentali complementari (2,12), diventa sempre piu’ convinzione comune che i neutrofili abbiano ruolo rilevante non solo nelle funzione difensive primarie, quali la fagocitosi e l’ eliminazione di batteri, ma anche nella modulazione e regolazione di processi piu’ complessi quali quello infiammatorio, immunitario e antitumorale, proprio attraverso la produzione di citochine (2,12). L'importanza, il ruolo e l'azione fisiologica e/o patogenetica della produzione di citochine da parte dei neutrofili nelle malattie infammatorie, infettive o autoimmunitarie sta, tra l’altro, acquisendo rilevanza dagli studi che si avvalgono di modelli animali, in cui, giusto per fare un esempio, e’ emerso che possono esistere delle sottopopolazioni di neutrofili che si possono caratterizzare proprio sulla base del “pattern” di citochine da loro prodotte (13,14). Diventa percio’ assai importante riuscire ad avere non solo una conoscenza il piu’ possibile approfondita della capacita' dei neutrofili di produrre citochine, ma anche di come tale funzione sia regolata a livello molecolare, durante le varie fasi dell' infiammazione e della risposta immunitaria. Cio’ per poter riuscire a essere in grado di valutare e, magari, di modulare lo "stato funzionale” di una delle principali componenti della risposta innata e il suo grado di interazione con le altre componenti del sistema immune.
Nel campo dell’immunita’ innata, recentemente e’ stata identificata una famiglia di recettori di membrana evolutivamente conservati, i recettori Toll-like (TLR1-10) responsabili della capacita’ delle cellule deputate alle difese, inclusi i neutrofili, di riconoscere componenti molecolari dei patogeni (denominati PAMP) (15,16). Le funzioni mediate dai TLR, attraverso vie di segnalazione che sono meglio conosciute nel topo rispetto all’uomo, portano alla rapida produzione di citochine proinfiammatorie, promuovono la maturazione delle cellule dendritiche e favoriscono una risposta immunitaria orientata (15,16). I granulociti polimorfonucleati neutrofili esprimono livelli misurabili di RNAm per tutti i TLR, tranne TLR3 e TLR9 (17), ma, dopo trattamento con GM-CSF, anche di TLR9 (18). Tuttavia, le informazioni sul ruolo e soprattutto sui meccanismi molecolari e biochimici alla base della capacita’ dei TLR di modulare l’espressione di citochine e di altre molecole implicate in funzioni effettrici dei neutrofili umani sono praticamente sconosciuti (17). In questo ambito, una delle linee di ricerca che si intende proporre deriva da osservazioni della nostra U.O. pubblicate in due lavori del 1997 (7) e 1999 (8) nei quali, pur dimostrando che neutrofili e monociti umani possono produrre la chemochina CXCL10/IP-10, gia’ mettevamo in evidenza sostanziali differenze tra questi due tipi cellulari a livello dei meccanismi di controllo dell’espressione genica (confermando tra l’altro un concetto da noi gia’ evidenziato in lavori precedenti studiando altri geni). Dimostrammo, infatti, che i neutrofili umani possono esprimere l’RNAm per CXCL10/IP-10 solo se costimolati con IFNgamma insieme a LPS o a TNFalfa. Nel caso dei monociti, invece, osservammo che per indurre l’espressione di CXCL10/IP-10 bastava una stimolazione singola: o con LPS, o, piu’ efficacemente, con IFNgamma. E’ importante sottolineare che tutte queste nostre osservazioni sono state successivamente confermate da altri gruppi (19) e perfino estese da studi condotti in vivo (20). In seguito all’identificazione dei vari TLR e soprattutto del TLR4 come recettore per LPS (21), fatte successivamente alla pubblicazione dei nostri lavori, sono letteralmente esplosi gli studi sui meccanismi molecolari che controllano gli effetti biologici e funzionali mediati da tali recettori, principalmente grazie all’utilizzo di topi “knockout”. Da questi lavori, che sono in continuo e rapido aggiornamento, e’ emerso che, perlomeno nei macrofagi di topo, l’LPS, via TLR4, induce una serie di geni, alcuni dei quali per azione diretta ed espressi piu’ precocemente (cosiddetti geni MyD88-dipendenti), altri espressi invece piu’ tardivamente (tra cui proprio CXCL10/IP-10) che in realta’ sono attivati per azione indiretta (i geni cosiddetti MyD88-indipendenti) (15,22). Si ritiene pertanto che LPS attivi, rapidamente, un pattern di geni ad azione proinfiammatoria (p.es. TNFalfa e CXCL8/IL-8) e non solo (p.es IFNbeta), seguiti, in maniera ritardata, da un pattern di geni di tipo antivirale, dipendenti in realta’ dall’azione del fattore di trascrizione STAT1 a sua volta attivato dall’IFNbeta endogeno (geni quindi MyD88-indipendenti/IFNbeta dipendenti) il cui significato biologico e’ sconosciuto. A livello molecolare (sempre sulla base degli studi condotti nel topo), queste due classi di geni sarebbero controllate da vie di trasduzione distinte che coinvolgono, in sequenze precise, proteine adattatrici reclutate/complessate a TLR4 (come MyD88, MAL/TIRAP, TRIF, TRAM), varie chinasi (come IRAK1, IRAK2, IRAK-4, TBK1, IKKepsilon, e altre ancora) e fattori di trascrizione specifici (NFkB, AP-1, IRF-3, etc) (23) (24) (25).
Nell’ambito di queste problematiche, il presente progetto di ricerca si prefigge, in generale, di caratterizzare la capacita’ e le basi molecolari dei ligandi di TLR4 e TLR3 di modulare la sintesi e rilascio di citochine da parte dei neutrofili, monociti e macrofagi umani, utilizzando come modello CXCL10/IP-10, IFNbeta, IL-10 e altri geni. Le informazioni ottenute da questo studio aiuteranno a definire le basi molecolari attraverso le quali componenti microbici stimolano le celllule delll'immunita' innata nell'uomo.
