Le integrine sono un'ampia famiglia di recettori transmembrana abili a mediare adesioni cellula-cellula e cellula-matrice ed attivare in consenguenza molteplici vie di segnalazione intracellulare. Essendo sprovvisti di attività enzimatica intrinseca nella porzione intracitoplasmatica, le integrine trasducono segnali grazie all’associazione con adattatori e chinasi prossimali alla membrana a loro volta in grado di attivare famiglie di chinasi citosoliche quali protein chinasi C, small GTP proteine delle famiglia Ras e Rho, MAP o ERK chinasi (Defilippi et al, 1997, Giancotti and Ruoslahti, 1999). Studi condotti in larga parte in linee tumorali aderenti hanno messo in luce il ruolo cardine svolto da questi recettori nella regolazione dell'omeostasi tissutale e della comunicazione cellulare dimostrando che l’integrazione di segnali inviati da integrine e recettori per fattori di crescita possono regolare attivazione di fattori di trascrizione ed espressione genica e modulare quindi proliferazione, apoptosi, differenziamento e produzione di citochine e/o chemochine e (Defilippi et al 1997, Giancotti and Ruoslahti, 1999, Mainiero et al 2000). In cellule epiteliali umane normali di derivazione timica (TEC) abbiamo precedentemente dimostrato che il reclutamento di integrine a3b1 o a6b4 ai siti di adesione con timociti, o il loro cross-linking mediante mAbs, induce attivazione dei fattori di trascrizione NF-kB ed NF-IL6 associata ad espressione genica di IL-6 (Ramarli et al 1998) e a parziale protezione dall’ apoptosi indotta da deprivazione di fattori di crescita (Scupoli et al 2000). La capacità dei due eterodimeri di indurre attivazione di NF-kB ed NF-IL6 è apparsa di particolare interesse, vista 1) la cooperazione dei due fattori di trascrizione nella transattivazione genica non solo di IL-6, ma di varie citochine e chemochine coinvolte nel differenziamento delle cellule T (Akira and Kishimoto, 1997) e 2) l’attività esercitata da NF-kB e/o NF-IL6 nella regolazione della crescita, della sopravvivenza cellulare o del differenziamento di epiteli stratificati e complessi (Beg and Baltimore, 1996, Scatena et al, 1998 Diehl et al, 1998, Robinson et al, 1998, Oh et al, 1998,). I meccanismi molecolari che connettono gli intermedi molecolari delle vie di segnalzione attivate da integrine con la successiva attivazione di NF-kB ed NF-IL6 sono a tutt'oggi poco studiati in cellule normali. Tuttavia, le osservazioni riportate in linee epiteliali tumorali dimostrano che chinasi delle famiglie MEKK e MAP attivate da citochine o iperespresse a seguito di trasfezione regolano le modificazioni post-trascrizionali o la localizzazione cellulare di questi fattori e/o le funzioni biologiche ad essi connesse. In particolare è stato dimostrato che : a) MEKK1, MEKK2 e MEKK3 possono fosforilare IKKBa/b, innescando la degradazione di IkBa/b e quindi la traslocazione nucleare di NF-kB (Zhao and Lee 1999, Lee at al 1998) b) p38 ed ERK1/2 incrementano la capacità transattivante di NF-kB fosforilandone la subunità p65 (Jefferies and O'Neill 2000, Carter et al 1999, Vanden Berghe et al 1998) c) p38 fosforila isoforme di NF-IL6 e regola il differenziamento di fibroblasti tumorali o condrociti normali ( Engelman et al 1998, Zhen et al, 2000) d) p38 ed ERK1 modulano la risposta apoptotica, sebbene l’effetto positivo o negativo vari in relazione al sistema cellulare utilizzato, allo stimolo applicato e alla concentrazione di inibitori farmacologici utilizzata per distinguerne il coinvolgimmento selettivo (Jefferies and O’Neill 2000, Lee et al 1998, Zhao and Lee 1999). Per quanto concerne l'attivazione di NF-kB meccanismi aggiuntivi all'attività delle chinasi sovramenzionate sembrano includere l'attività enzimatica sulla fosforilazion di IkBa di un nuovo complesso proteico ( signalosoma) contenente JAB1, originariamente descritto come coattivatore del fattore di trascrizione c-Jun e più recentemente come molecola interattiva con le porzioni citosoliche di integrine beta-1 and beta-2 (Bianchi et al, 2000, Seeger et al, 1998). Nelle TEC normali abbiamo recentemente osservato che il cross-linking di integrine a6b4 induce attivazione sequenziale di Rac e MEKK3/6 e quindi di JNK, ERK-1 e p38 MAP chinasi e che tale attivazione si associa ad degradazione di IkB alfa, traslocazione nucleare di NF-kB e fosforilazione di NF-IL6. Risultati preliminari ottenuti mediante inibizione farmacologica selettiva di p38 o ERK-1 suggeriscono che nel nostro sistema cellulare p38 eserciti un ruolo preponderante rispetto ad ERK1 nella regolazione della traslocazione nucleare di NF-kB , della produzione costitutiva ed inducibile di IL-6, del differenziamento terminale in vitro e della regolazione negativa della risposta apoptotica.
Sulla base delle ossevazioni riportate in letteratura e dei dati ottenuti nel notro sistema sperimentale proponiamo quindi di approfondire lo studio dell'attività di chinasi MEKK e MAP e di JAB1 attivati da segnali originati da reclutamento di integrine beta-1 e beta-4 nella regolazione
A) dell'attivazione di fattori di trascrizione NF-kB ed NF-IL6 e della produzione di citochine e chemochine
B) della risposta apoptotica caspasi 9-dipendente
C) del differenziamento terminale in eventuale sinergia con l’attività di molecole modulatrici del potenziale elettrico di membrana ( canali Herg).
I risultati ottenuti consentiranno di ampliare le conoscenze sui alcuni dei meccanismi molecolari di controllo esercitato dalle integrine nel mantenimento dell'omeostasi tissutale del tessuto epiteliale timico normale e nella regolazione della produzione di fattori solubili che condizionano la corretta maturazione dei linfociti T.
