Nuovi recettori e mediatori dell'immunità innata

Data inizio
10 gennaio 2003
Durata (mesi) 
48
Responsabili (o referenti locali)
Cassatella Marco Antonio

I compiti dell’Unita’ di Ricerca (UR) sono integrati in tre workpackages: WP1, WP2 e WP3.
  • WP1. NUOVE MOLECOLE COINVOLTE NELL'IMMUNITA' INNATA.
    Ruolo funzionale dei NIRAM nei neutrofili.
    Allo scopo di comprendere e chiarire gli eventi che regolano la produzione di citochine e altre funzioni effettrici dei neutrofili ci prefiggiamo di:
    • TASK 1: studiare l’espressione dei membri della famiglia dei recettori simil-TOLL (TLR) e delle altre proteine extracellulari ed intracellulari ad essi complessati. In particolare, in collaborazione con l’UR#1, intendiamo studiare la modulazione dell’espressione di queste proteine in risposta a peptidi chemiotattici di derivazione batterica (fMLP) e/o chemochine tipo IL-8 e GROa;
    • TASK 2: chiarire se DNA di derivazione batterica e’ in grado di stimolare i PMN umani a produrre classi di citochine specifiche e/o di modulare altre attivita’ funzionali tipiche di queste cellule (Scapini et al. IMMUNOL REV 177;195,2000). La capacita’ del DNA batterico e di oligonucleotidi sintetici in grado di mimare il DNA batterico (contenenti sequenze CpG, detti CpG-DNA), di attivare le risposte funzionali delle cellule dell’immunita’ innata come macrofagi e cellule dendritiche, attraverso TLR-9, rappresenta l’esempio piu’ eclatante di come nuovi recettori implicati nel riconoscimento degli agenti patogeni (PAMP) possano influenzare lo sviluppo dell’immunita’ specifica. Allo stato attuale, tuttavia, non e’ noto se DNA batterico o oligonucleotidi CpG-DNA sono in grado di stimolare anche i neutrofili; (TASK 3) caratterizzare in maniera dettagliata, in collaborazione con l’UR#5, le attivita’ funzionali dei neutrofili vengono stimolate dai recettori TREM-1 e TREM-2.
  • WP2. CARATTERIZZAZIONE DELLE INTERAZIONI LIGANDO/RECETTORE.
    Basi molecolari della risposta all’IL-10 da parte di fagociti.
    Nel corso degli ultimi anni il gruppo del proponente ha contribuito a delineare i meccanismi biochimici e molecolari attraverso i quali l’IL-10 modula negativamente la produzione di citochine/chemochine proinfiammatorie indotta da LPS o da altri agonisti da parte dei PMN (Cassatella, M.A. The neutrophil: one of the cellular targets of IL-10. Int.J.Clin.Lab.Res. 1998;28:148-161).
    Recentemente, abbiamo identificato l’esistenza di una sorta di circuito feed back negativo nel quale l’endotossina, aumentando l’espressione di IL-10R1, rende i neutrofili in grado di rispondere all’IL-10, facendo in modo che le funzioni cellulari proinfiammatorie si spengano (Crepaldi et al. J Immunol. 2001; 167:2312-22). Ci si prefigge ora di:
      TASK 1: chiarire se, oltre all’LPS, altri mediatori, notoriamente capaci di modificare lo stato funzionale dei PMN, sono in grado di renderli funzionalmente responsivi all’ IL-10, e, se si’, se tali mediatori agiscono inducendo/aumentando l’espressione di IL-10R1;
    • TASK 2: definire le vie di trasduzione responsabili dell’attivazione trascrizionale del gene IL-10R1 indotta dall’ endotossina (ed eventualmente dagli altri stimoli ugualmente efficaci);
    • TASK 3: definire se, e quali degli effetti biologici di tipo antinfiammatorio dell’IL-10 sono mediati dall’induzione di SOCS3 e/o dall’attivazione di STAT3. A questo fine useremo diversi approcci. Uno di questi e’ quello di trasfettare stabilmente con un costrutto Myc-SOCS3 (clonato in un vettore di espressione pcDNA3, gentilmente fornito dal Dr. A. Yoshimura, Universita’ di Kyushu, Giappone) cellule macrofagiche murine appartenenti alla linea cellulare J774. In questi cloni si verifichera’ se LPS conserva la capacita’ di indurre tutti quei classici effetti proinfiammatori che sono notoriamente soppressi dall’IL-10. I macrofagi trasfettati stabilmente con SOCS3 saranno anche utilizzati come modello sperimentale per chiarire se SOCS3 gioca un ruolo nel meccanismo di generazione di recettori chemochinici che agiscono come “decoy” (in collaborazione con l’UR#1). Un altro approccio per chiarire gli effetti biologici conseguenti all’induzione di SOCS-3 nei PMN da parte di IL-10 (in combinazione o no con LPS) sara’ quello di bloccarne l’induzione utilizzando oligonucleotidi antisense fosforotioati. Infine, cercheremo di bloccare la capacita’ dell’IL-10 di attivare STAT3 utilizzando la tecnologia dei peptidi Troiani tipo penetratina-1, che sono in grado di trasportare molecole solubili normalmente incapaci di oltrepassare la membrana cellulare. Disegneremo e produrremo peptidi ricombinanti antagonisti di IL-10R1 e/o STAT3 per verificare, nei neutrofili, quali degli effetti dell’IL-10 verranno inibiti;
    • TASK 4: clonare il promotore di IL-10R1, e, successivamente, anche di IL-10R2 (partendo da una library genomica fornita dal Dr. De Waal Malefyt, DNAX, Palo Alto, USA), al fine di identificare le sequenze regolatrici della loro espressione genica.
  • WP3. PROFILI TRASCRIZIONALI.
    Analisi proteomica di neutrofili attivati da NIRAM.
    Le cellule del sistema immunitario comunicano tra di loro mediante la secrezione di numerose molecole di natura polipeptidica. Sebbene molte di queste siano state identificate e studiate, mancano informazioni sulla modificazione globale della secrezione di polipeptidi conseguente a stimoli importanti per la induzione/modulazione della risposta innata. Per rispondere a tali quesiti verrà utilizzata una nuova tecnologia nota come "analisi del proteoma", cioè l'analisi in larga scala delle proteine, che si basa, nella sua applicazione più diffusa, sulla separazione di miscele proteiche complesse in gel di elettroforesi bidimensionali (Pandey & Mann. Proteomics to study genes and genomes. Nature 2000; 405:837-46). Dopo l'identificazione delle proteine nel gel attraverso un'analisi computerizzata, è possibile isolarle e determinarne la sequenza utilizzando metodiche altamenete sensibili che si basano sulla cromatografia in fase liquida e la spettrometria di massa. Con l’approccio del “proteoma” cercheremo di identificare, nei sopranatanti, i polipeptidi sintetizzati in eccesso/difetto o che subiscano modificazioni post-traduzionali in seguito al trattamento di popolazioni di neutrofili e leucociti mononucleati autologhi con ligandi (tipo LPS, DNA batterico, oligonucleotidi CpG-DNA) per recettori NIRAM (p.es. TLR4, TLR9, TREMs). Dall'applicazione di tale metodica ci si attende di ottenere una mappatura del profilo di secrezione di neutrofili sottoposti a stimoli rilevanti per le risposte innate e la conseguente sequenza diretta dei prodotti di secrezione ritenuti più significativi. Tra questi potrebbero essere identificati nuovi prodotti genici che verrebbero identificati.

Enti finanziatori:

Ministero dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca
Finanziamento: assegnato e gestito da un ente esterno all'ateneo
Programma: FIRB

Partecipanti al progetto

Flavia Bazzoni
Professore associato
Federica Calzetti
Tecnico-Amministrativo
Marco Antonio Cassatella
Professore ordinario
Sara Gasperini
Tecnico-Amministrativo
Vincent Le Moigne
Daniela Margotto
Patrizia Scapini
Ricercatore
Claudio Sorio
Professore associato
Nicola Tamassia
Tecnico-Amministrativo

Attività

Strutture