RNA E NANOTECNOLOGIE NEL CONTROLLO DELL’IMMUNOSOPPRESSIONE NEOPLASTICA SOSTENUTA DAL CATABOLISMO DEGLI AMINO ACIDI

Data inizio
22 febbraio 2012
Durata (mesi) 
36
Responsabili (o referenti locali)
Bronte Vincenzo

Task 1 - Aim 1. Profili di espressione di RNA basati su Affymetrix sono stati ottenuti da MDSCs isolate dalla milza e dall’ambiente tumorale di topi con differenti tumori trapiantabili (background murini C57BL/6 e BALB/c); questi dati includono anche subsets di MDSCs granulocitiche o monocitiche altamente purificati. Verranno anche forniti set di dati di espressione genica di subsets di MDSCs umane, grazie ad un finanziamento già concesso.
Task 1- Aim 2. Creeremo costrutti contenenti luciferasi insieme a parti del promotore di Arg1. Eseguiremo una vasta analisi delle possibili interrelazioni tra citochine, IDO e ARG1 nelle MDSCs e cellule tumorali.
Task 1-Aim 3. L’Unità 3 ha dimostrato che il fattore di trascrizione C/EBPb è sorvaespresso nelle MDSCs di topi con differenti tipi di tumore. Le MDSCs in topi deleti di C/EBPb ed affetti da tumore hanno perso completamente le proprietà immunosoppressive verso i linfociti T CD8+. Inoltre, l’ablazione selettiva di questo fattore nel compartimento emopoietico è sufficiente a convertire una risposta immune inefficiente in una risposta completamente terapeutica contro il cancro, suggerendo che questo fattore di trascrizione è cruciale per la tolleranza indotta dai tumori (Marigo, Immunity 2010). L’espressione di varie isoforme di C/EBPb è indotta in maniera distinta durante la differenziazione in macrofagi e/o granulociti ed è anche regolata differenzialmente dall’attività di IDO e Arg1 (dati non mostrati e: Baban, Blood, 2009). Continueremo la caratterizzazione delle interazioni reciproche tra le varie isoforme di C/EBPb (sono già stati prodotti costrutti plasmidici che li esprimono) e gli enzimi che metabolizzano gli aminoacidi in MDSCs fresche ed immortalizzate.
Task 2 - Aim 1 e 2. Abbiamo già acquisito il ceppo murino reporter per ARG1. I topi YARG sono stati creati inserendo la proteina reporter “enhanced yellow fluorescent protein”(EYFP) in un costrutto di espressione bicistronico IRES al’estremo 3’ del gene ARG1. Collaboreremo alla realizzazione di un topo reporter per IDO e monitoreremo ex vivo ed in vivo (utilizzando imaging a due fotoni) le proprietà funzionali delle cellule esprimenti IDO, Arg1 o entrambi gli enzimi. Per analizzare campioni di tessuti situati in profondità, come nel caso di impianti tumorali, useremo il microscopio a scansione laser multifotonica. Il microscopio multifotonico può acquisire immagini con risoluzione laterale submicronica e micronica assiale in una scala di tempo di millisecondi.
Per monitorare otticamente le dinamiche cellulari, sottoporremo ad imaging il tumore e le cellule infiltranti il tumore, dopo trasferimento adottivo di popolazioni mieloidi selezionate da topi reporter singoli e doppi. Useremo una finestra cutanea con camera fenestrata, che consiste di due strutture complementari di leghe di titanio ed un'apertura centrale di 1-cm di diametro. La camera offre il vantaggio primario di permettere a tumori e tessuti di essere analizzati serialmente per giorni e fino a due settimane, con risoluzione e chiarezza eccellenti e senza danno ai tessuti. Nella camera possono essere coltivate svariate linee cellulari umane e murine.
Task 3 - Aim 1-3. Contribuiremo a generare topi doppi knockout null per IDO e knockout condizionali per Arg1. Questi topi ci permetteranno di determinare se le due vie metaboliche mostrano effetti sinergici nella tolleranza indotta dal tumore. In questi topi indurremo la crescita, sia di tumori solidi che ascite e, a tempi differenti, analizzeremo le cellule infiltranti il sito tumorale, la milza, i linfonodi o il midollo osseo. Ne caratterizzeremo il fenotipo al FACS, insieme alla loro potenzialità di differenziamento e proliferazione in vitro ed in seguito a trasferimento adottivo in vivo. Infine, analizzeremo la loro capacità di soppressione dell’attività citotossica di cellule T CD8+ o di reclutamento di linfociti T regolatori. Un altro punto importante da determinare è se la concomitante deplezione di Arg1/IDO avrà un impatto sull’accumulo di MDSCs negli organi linfoidi secondari.
Task 5 - Aim 1. L’Unità 3 è parte del consorzio LYMPHOTARG, finanziato da una sovvenzione proveniente dalla Comunità Europea, che si pone l'obiettivo di sfruttare una strategia multidisciplinare, che combina nanotecnologia e biomedicina, per lo sviluppo di trattamenti antitumorali indirizzati specificamente ai linfonodi. Il progetto LYMPHOTARG trarrà vantaggio dalla capacità di nanoparticelle brevettate dai partners di localizzarsi nei linfonodi, con lo scopo di recapitare farmaci e complessi immunostimolanti a questo compartimento, prevenendo il processo di disseminazione metastatica attraverso i vasi linfatici. Nel presente progetto, queste particelle saranno usate per veicolare small RNAs in grado di spegnere l’espressione di geni bersaglio selezionati come Arg1, IDO o fattori di trascrizione che ne controllano l’espressione nei linfonodi drenanti il tumore. Alternativamente, una nanoparticella basata su dendrimeri poliamidici è in fase di ottimizzazione per la consegna di small-RNAs a cellule mielomonocitiche capaci di raggiungere l’ambiente tumorale e svilupparsi come macrofagi tumore-associati.
Risultati attesi: 1) creazione di nuovi ceppi murini transgenici e knock out per studiare la regolazione spaziale e temporale di IDO e ARG1 durante la progressione tumorale, una informazione basilare per la razionalizzazione dei protocolli terapeutici; 2) identificazione di biomarcatori predittivi della progressione della malattia o della risposta alla terapia nei pazienti con cancro; 3) valutazione preclinica di nuove strategie basate sul recapito di nanoparticelle nell’ambiente tumorale; 4) trasporto selettivo di small-RNAs interferenti con le vie metaboliche di IDO e Arg1 (si presume che i punti 3 e 4 possano dare origine a scoperte brevettabili).

Enti finanziatori:

Ministero dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca
Finanziamento: assegnato e gestito dal Dipartimento

Partecipanti al progetto

Cristina Anselmi
Tecnico-Amministrativo
Vincenzo Bronte
Professore ordinario
Tiziana Cestari
Tecnico-Amministrativo

Attività

Strutture