Mappa proteomica dell'eritrocita: implicazioni cliniche e terapeutiche

Data inizio
10 gennaio 2003
Durata (mesi) 
36
Dipartimenti
Medicina
Responsabili (o referenti locali)
De Franceschi Lucia

Il mantenimento di un costante volume cellulare di fronte a cambiamenti di osmolarità intra ed extracellulare rappresenta uno stimolo importante, affrontato da tutte le cellule. La maggioranza delle cellule risponde all’aumento e alla riduzione del volume cellulare attraverso l’attivazione di specifici metabolici o di sistemi di trasporto ionico che riportano la cellula al suo volume originario ed al suo stato di riposo. Questi processi fanno parte della normale funzione della cellula. Molti di questi sistemi di trasporto sono ubiquitari e quindi il globulo rosso può rappresentare un ottimo modello per la caratterizzazione della loro funzione e la successiva applicazione in altre cellule eucariote. La nostra Unità di Ricerca, negli ultimi dieci anni, ha contribuito alla caratterizzazione della funzione di alcuni di questi sistemi di trasporto cationico di membrana e di canali ionici.
I sistemi di trasporto cationico di membrana che regolano l’omeostasi cationica cellulare possono essere suddivisi in tre gruppi a seconda delle loro caratteristiche funzionali: i trasporti energia dipendenti come la pompa Na-K ATPasi, i sistemi gradiente dipendente quali il cotrasporto Na-K-2Cl o il cotrasporto K-Cl ed infine i canali ionici come il canale Ca2+ -K+ attivato, noto come canale Gardos ed i canali voltaggio dipendenti.
Alterazioni della funzione dei sistemi di trasporto cationico di membrana e/o dei canali ionici sono stati descritti in patologie ereditarie del globulo rosso legate a mutazioni delle catene emoglobiniche, ad anomalie della membrana eritrocitaria o degli enzimi eritrocitari.
Patologie ereditarie delle catene emoglobiniche: L’anemia falciforme (HbS), si caratterizza per la presenza di globuli rossi disidratati che sono il risultato dell’alterata funzione di alcuni sistemi cationici di trasporto di membrana, come il K-Cl cotrasporto che in concomitanza all’abnorme attivazione del canale Gardos, e’ responsabile della fuoriuscita di K+ ed acqua dal globulo rosso. I globuli rossi così disidratati e contenenti polimeri di Hb S, svolgo un ruolo cruciale nella patogenesi delle crisi vaso-occlusive e nei danni d'organo caratteristiche dell'anemia falciforme. La nostra Unita’ di Ricerca ha contribuito a caratterizzare la funzione del K-Cl cotransporto sia nei globuli rossi di pazienti affetti da anemia falciforme che in modelli murini transgenici per la drepanocitosi. La recente sequenziazione della famiglia di trasportatori di cui fa parte il cotrasporto K-Cl (KCC1) e il cotrasporto Na-K–2Cl ha permesso di ipotizzare una funzione delle diverse regioni della proteina trasportatrice come, per esempio, l'individuazione di siti di fosforilabili/defosforilabili; solamente un approccio proteomico può permettere di individuare con certezza i siti fosforilati/defosforilati. Il cross-talk tra proteina trasportatrice e kinasi/fosfatasi è stato recentemento messo in luce in globuli rossi di topi knockout per due tirosin kinasi della famiglia del Src (Fgr, Hck) abbiamo evidenziato come il cotrasporto K-Cl sia abnormemente attivato negli eritrociti dei topi privi di tali kinasi. In un secondo modello murino ( ceppi MGH/MGL) abbiamo evidenziato l’esistenza un cross-talk tra Fgr/Hck e almeno una delle isoforme della famiglia delle serin-treonin fosfatasi: PP-1? nella regolazione dell’attività del K-Cl cotrasporto.
I dati raccolti sono però alquanto preliminari e limitati dall' uso in vitro di inibitori/attivatori di famiglie di fosfatasi e kinasi che possono agire su più target contemporaneamente e quindi non permettono di studiare il cross-talk struttura/funzione tra proteina trasportatrice/canale ionico e fosfatasi/kinasi che la possono regolare.
Patologie ereditarie della membrana eritrocitaria: I sistemi di trasporto cationico di membrana risultano alterati anche in patologie quali la stomatocitosi ereditaria, le sferocitosi, cosi' come l'acantocitosi. In queste patologie è stata documentata anche un'anomalia della funzione dello scambiatore anionico e/o del canale Gardos. Lo scambiatore anionico, localizzato nella banda 3, svolge anch'esso un ruolo cruciale nella regolazione del volume eritrocitario. I dati raccolti fino ad ora sono di tipo descrittivo e questo approccio non consente la correlazione tra anomalia di funzione e struttura proteica. Rimangono a tuttora da studiare il ruolo di sistemi di trasporto ionico di membrana nel riarrangiamento del citoscheletro prima nel globulo rosso normale e successivamente in quello patologico. L'approccio proteomico permetterebbe quindi di associare le alterazioni della funzione dei trasportatori di membrana ed il fenotipo proteico.
La presente Unità di Ricerca è in grado di studiare e caratterizzare la funzione dei principali sistemi di trasporto cationici di membrana e del canale Gardos nei globuli rossi e nei precursori eritroidi con tecniche di in/efflusso di Na e/o K che può prevedere l'uso anche di traccianti radioattivi. Tramite l'uso di tecniche di immunoblot e di saggi enzimatici su materiale, immuno-precipatato con anticorpi specifici, possiamo valutare l'espressione e la funzione di alcune tirosin kinasi della famiglia del Src e di alcune isoforme di serin-treonin fosfatasi PP-1, che recentemente abbiamo descritto essere coinvolti nella regolazione dell'attività del K-Cl cotrasporto.
Inoltre, la nostra disponibiltà di ceppi murini transgenici per l'anemia falciforme, per la talassemia così come di ceppi murini knockout per tyrosin-kinasi della famiglia del Src o per tirosin fosfatasi (PTPepsilon) ci permetterebbe di identificare target proteici che possono svolgere un ruolo cruciale nella patologia eritrocitari. Lo studio della funzione di alcune di queste chinasi e fosfatasi potrà essere ulteriormente estesa in collaborazione con il Dipartimento di Biochimica dell'Università di Padova, con la caratterizzazione di substrati e di cinetica enzimatica.
Qualora lo preveda la nostra Unità di Ricerca può ulteriormente studiare la funzione di una proteina trasportatrice dopo transfezione con microiniezione dell' mRNA corrispondente in ovociti di Xenopus laevis, che presentano la peculiarità di non possedere sistemi di trasporto di membrana volume regolatore eccetto per il Na-K-2Cl cotrasporto. Utilizzando tale metodica abbiamo caratterizzato l'attività del K-Cl cotrasporto murino ed abbiamo contribuito a identificarne alcuni dei fattori modulanti.
L'approccio proteomico consente di caratterizzare la struttura delle proteine trasportatrici (trasporti cationici e/o canali ionici) di individuare i rapporti proteina/proteina e di caratterizzare la cascata di attivazione/inattivazione dei sistemi di trasporto di membrana. L'acquisizione di questi dati può permettere la redazione di una mappa delle proteine trasportatrici di membrana nel globulo rosso normale, che può essere utilizzato come referenza per lo studio delle stesse nei globuli rossi patologici. La mappa proteomica potrebbe essere utilizzata per sviluppare nuove metodiche di diagnostica e potrebbe permettere di identificare target farmacologici per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche.

Enti finanziatori:

Ministero dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca
Finanziamento: assegnato e gestito da un ente esterno all'ateneo
Programma: FIRB

Partecipanti al progetto

Andrea Biondani
Roberto Corrocher
Professore emerito
Lucia De Franceschi
Professore associato
Lorenzo Moretti
Michela Pasino
Patrizia Pattini
Tecnico-Amministrativo
Christian Pozzobon
Angela Siciliano
Tecnico-Amministrativo
Annamaria Stanzial

Collaboratori esterni

Anna Maria Brunati
Univeristà di Padova Dip. di Chimica Biologica Ricercatore
Pubblicazioni
Titolo Autori Anno
Monohydroxyethylrutoside (MonoHER), a novel antioxidant agent, reducess membrane oxidative damage in vivo in a mouse of beta thalassemia. L. De Franceschi, F. Turrini, M. Honezarenko, Koji Ayi, M.D. Fleming, T. Law, S. Gotta, F.A. Kuypers, A. Bast, W.J.F. van der Vjigh, C. Brugnara 2002
K-Cl cotransport modulation by intracellular Mg in erythrocytes from mice bred for low and hig Mg levels. L. De Franceschi, E. Villa-Moruzzi, L. Fumagalli, C. Brugnara, F. Turrini, R. Motta, E. Veghini,C. Corato, S.L. Alper, G. Berton 2001
Mouse K-Cl cotransporte KCC1: cloning, mapping, pathological expression and functional regulation. S.W.; B.E. Shmukler; M.N. Chernovaa; A.K. Stuart-Tilley; L. De Franceschi; C. Brugnara; S.L. Alper. 1999

Attività

Strutture