Gli esperimenti che vogliamo svolgere intendono chiarire alcuni aspetti sconosciuti o non sufficientemente chiariti riguardanti i meccanismi di espressione di componenti della NADPH ossidasi in monociti, macrofagi e cellule dendritiche. Il modello sperimentale che useremo sarà il seguente: i monociti umani verranno isolati dal sangue di donatori sani tramite gradiente Percoll, posti in coltura, e fatti differenziare a macrofagi in presenza o assenza di varie combinazioni di citochine e/o chemochine (ad es. citochine "proinfiammatorie", quali TNF-alfa, interferone-gamma, IL-1, citochine "antinfiammatorie" quali IL-4, IL-10, IL-13, chemochine quali IL-8, MCP, MIP, RANTES, nonchè citochine che inducono la differenziazione dei monociti a cellule dendritiche (ad es. IL-4+GM-CSF o IL-13+GM-CSF). A vari stadi di maturazione (e cioè a vari tempi di coltivazione) i nuclei delle cellule verranno isolati e l'associazione di vari fattori di trascrizione ai promoters dei geni codificanti i componenti dell'NADPH ossidasi verrà studiata tramite saggi di gel-shift (EMSA) con specifici oligonucleotidi marcati riproducenti le più importanti regioni di tali promoters. Le proteine componenti i vari complessi rivelati da tali esperimenti verranno identificate tramite saggi di supershift con anticorpi specifici o saggi di competizione utilizzando oligonucleotidi non marcati contenenti o meno mutazioni a livello delle consensus sequences dei vari fattori di trascrizione (es. PU-1, CP1, CDP, IRF-1, IRF-2, YY1, Elf-1).Tali esperimenti, uniti a ulteriori saggi di gel-shift condotti con l'aggiunta agli estratti nucleari di un eccesso di regolatori trascrizionali ricombinanti, ci permetteranno di comprendere l'influenza di ciascuna proteina sulla formazione dei diversi complessi legati al DNA. In parallelo verranno condotte le seguenti ricerche:1) Un'analisi dei secondi messaggeri implicati nel controllo dell'associazione dei fattori di trascrizione al DNA, sia nelle interazioni fra i diversi fattori di trascrizione che portano alla formazione dei diversi complessi osservati negli esperimenti di gel shift. vA tale scopo, prima dell'effettuazione degli esperimenti di gel-shift e supershift, le cellule verranno coltivate con o senza aggiunta di citochine secondo il modello su descritto e in assenza o presenza di generici inibitori di serina chinasi (staurosporina), di tirosina chinasi (genisteina) o di fosfatasi (okadaic acid, vanadato, calyculin A). Inoltre, le vie di transduzione coinvolte saranno esplorate mediante l'utilizzo di inibitori più selettivi, come la wortmannina e LY294002 (inibitori di fosfatidilinositolo 3-chinasi), l'SB203580, PD098059, PD184352 (inibitori di MAP-kinasi), la Daidzeina e la Emodina (inibitori di casein chinasi II), la cheleritrina cloruro, il Go6976 e il Go6850 (inibitori di protein chinasi C). L'analisi verrà ulteriormente approfondita utilizzando i seguenti tre approcci sperimentali: a) utilizzo di cellule da topi knock-out per le tirosin chinasi Fgr, Hck; b)analisi dell'effetto di peptidi miristilati (in grado di accumularsi sulla porzione interna della membrana plasmatica) con sequenze derivate dalle regioni pseudo substrato di varie isoforme di protein chinasi C (taz e nel nucleo) con sequenze vettrici trans membrana derivate dalla Antennapedia (fattore di trascrizione della Drosofila) e con sequenze cargo derivate da specifiche regioni effettrici delle small GTP binding proteins H-ras (aa. 19-41) e RhoA (23-40 e 95-119); quest'ultimi due approcci permetteranno un'analisi selettiva senza dover ricorrere a transfezioni cellulari; inoltre, nel caso dei peptidi trojani derivati dall'H-Ras e dalla RhoA, permetteranno lo studio di importanti domini funzionali di tali molecole nel contesto sperimentale prescelto. I peptidi miristilati sintetici sono già stati pubblicati (Laudanna et al, JBC, 1998) e sono disponibili; i peptidi trojani saranno prodotti sia come peptidi ricombinanti (espressi e purificati da batteri)(quelli derivati dalla RhoA sono già disponibili) sia come peptidi sintetici. Tali esperimenti saranno poi completati con saggi di immunoprecipitazione di fattori di trascrizione, scelti anche in questo caso sulla base dei risultati dei suddetti esperimenti, e successivo immunoblotting con anticorpi anti-fosfotirosina e antifosfoserina, e saggi di chinasi in vitro condotti tramite aggiunta ai lisati cellulari di substrati di protein chinasi(ad esempio caseina, istoni, MAP-chinasi) in presenza di ATP marcato. Altri esperimenti saranno condotti usando monociti mantenuti in sospensione (cioè coltivati in piastre di teflon) per comprendere il ruolo dell'adesione delle cellule ai pozzetti di coltura in ogni risultato ottenuto.vAbbiamo anche previsto esperimenti di gel-shift e supershift in presenza di agenti riducenti (ad es. Dithiothreitol) o ossidanti (ad es. H2O2) o dopo coltura delle cellule in presenza di inibitori di flavoproteine (ad es. Difenilene iodonium), al fine di studiare il ruolo di reazioni di ossidoriduzione nell'attivazione dei fattori di trascrizione in oggetto. Tali studi hanno una particolare rilevanza visto che l'enzima studiato è una ossidasi che pertanto potrebbe autoregolare la propria attività ed espressione in base all'entità della produzione di radicali liberi dell'ossigeno. A questo scopo prevediamo di poter fare esperimenti anche utilizzando cellule di pazienti affetti da Malattia Granulomatosa Cronica, i cui leucociti non producono radicali liberi dell'ossigeno, e che sono pertanto utilissime per chiarire il ruolo dei radicali in vari processi. vTutti gli esperimenti di cui sopra verranno condotti in parallelo anche su linee cellulari mieloidi (U937, HL60...) esprimenti o no l'NADPH ossidasi e/o su cellule che esprimono l'NADPH ossidasi a livelli molto più bassi di quelli dei fagociti, quali ad esempio i fibroblasti ed i linfociti B, per comprendere se in queste cellule i meccanismi di espressione della NADPH ossidasi sono simili o no a quelli osservati nei monociti/macrofagi.
2) Prove funzionali tramite permeabilizzazione delle cellule e inserzione di oligonucleotidi (o anticorpi) bloccanti l'uno o l'altro fattore di trascrizione, oppure tramite l'uso di oligonucleotidi fosforotioati che passano attraverso le plasmamembrane come competitori. Una volta inibita l'azione di selezionati fattori di trascrizione nelle cellule intere si procederà a: 1) misurazioni spettrofotometriche della produzione di anione superossido in risposta a stimolazione con esteri del forbolo (PMA); 2) Western e Northern blotting per rilevare le variazioni dell'espressione dei vari componenti dell'NADPH ossidasi sia come mRNA che come proteine. Questi esperimenti verranno condotti in monociti e macrofagi a vari stadi di differenziazione e trattati o meno con citochine e chiariranno quali fattori di trascrizione sono implicati nel calo spontaneo dell'attivabilità dell'enzima durante la differenziazione dei monociti a macrofagi, nella sua responsività alle citochine, e nell'espressione di determinati componenti della NADPH ossidasi.
